Page 117 - ปฏิบัติการ Lab Bilology II

ี
บทปฏบัติการท 9 การแยกสกัดดเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม
ี�
ิ
DNA Extraction and Genetic Engineering 109
วัตถุประสงค
่
ื
ึ
็
ี
ี
ั
ิ
1. เพอใหนิสิตเขาใจถงหลักการและวิธีการในการแยกสกดพลาสมดดเอนเอจากเซลลของสิ่งมชีวิต
ดวยวิธี alkaline lysis ไดอยางถูกตองตามหลักการของการสกัดกรดนิวคลีอิก
ื
ี
็
2. เพ่อใหนิสิตเขาใจถึงหลักการและวิธีการในการการโคลนยีนโดยอาศยพลาสมดดเอนเอของ
ั
ิ
แบคทเรีย
ี

กิจกรรมที่ 9.1 การสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอจากเซลลแบคทีเรียดวยวิธี Alkaline Lysis
วัสดุอุปกรณและสารเคม ี
่
1. เซลลแบคทีเรียที่เลี้ยงในอาหารสังเคราะห Nutrient Broth เปนเวลา 12 ชัวโมง
2. Solution I : 50 mMTris-EDTA pH 8.0
3. Solution II : NaOH/SDS lysis solution (0.2 NNaOH, 1% (w/v) SDS)
4. Solution III : 3M potassium acetate solution (pH 4.8)
5. 95% แอลกอฮอล
6. น้ํากลั่น
7. หลอดทดลองขนาดกลาง

8. ปเปตขนาด 1 มิลลิลิตร
9. ปเปตขนาด 5 มิลลิลิตร
10. จุกยางดูดสาร

11. กระดาษทิชชู

วิธีการทดลอง

1. เตรียมเซลลแบคทีเรียโดยทําการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อเปนเวลา 12 ชัวโมง
่
2. นําหลอดทดลอง 3 หลอดใสเซลลแบคทีเรียประมาณ 1 มิลลิกรัม แลวเขยนหมายเลข 1 ถง 3
ึ
ี
3. เติม solution I ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใสหลอดทดลองหมายเลข 1 ถง 3 โดยทาการเขยาหรือ
ึ
ํ
ใหเซลลผสมเปนเนื้อเดียวกับสารละลาย
ิ
4. เติม solution II ปริมาตร 1 มลลิลิตรใสหลอดทดลองหมายเลข 1 และ 3 แลวทําการเขยา
หรือกลับหลอดทดลองเบา ๆ
5. เติมน้ํากลั่นลงในหลอดหมายเลข 2 แลวทําการเขยาหรือกลับหลอดทดลองเบา ๆ
ํ
ิ
6. เติม solution III ปริมาตร 1 มลลิลิตร ใสหลอดทดลองหมายเลข 1 และ 2 แลวทาการเขยา
หรือกลับหลอดทดลองเบา ๆ ในขั้นตอนนี้จะเกิดตะกอนสีขาว
ิ
ึ
7. เตมแอลกอฮอล 95 เปอรเซนต ปริมาตร 5 มลลิลิตร ลงในหลอดทดลองหมายเลข 1 ถง 3

็
ิ
้
ิ
แลวทําการผสมใหเขากันดวยการพลิกหลอดไปมาเบา ๆ ประมาณ 10 ครั้ง (ระวังอยาใหเกิดฟอง) แลวตงท้งไว
ั
ึ
ประมาณ 5 นาที สังเกตโมเลกุลของดีเอ็นเอที่เกิดในแตละหลอดแลวบันทกผลการทดลอง