Page 113 - ปฏิบัติการ Lab Bilology II

ี�
ี
ิ
บทปฏบัติการท 9 การแยกสกัดดเอ็นเอและพันธุวิศวกรรม
DNA Extraction and Genetic Engineering 105
่
ี
ึ
่
่
ี
ี
ั
ปจจัยท่มผลกระทบตอคุณภาพของดีเอ็นเอ การแยกสกดดีเอ็นเอจากสิงมีชีวิตสิงทตองคํานึงถง
ี


ี
ี่

เรื่องของความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่เตรียมได โดยดเอนเอทมคณภาพดตองปราศจากการปนเปอนของโมเลกล
ุ
็
ี

ุ
่

ึ
์
ั

อื่นที่ไมตองการ เชน โปรตีน ไขมน และโพลีแซคคาไรด เปนตน ซงวิธีในการตรวจสอบความบริสุทธิของดีเอน
็
ั
่
ิ
เอสามารถพจารณาไดจากการเปรียบเทยบอตราสวนของการดดกลืนแสงของกรดนิวคลีอกกับโปรตนทความ
ี
ี

ิ
ี
ู
ี
ี
ิ
่
์
ี


ั
ี

ยาวคลื่น 260/280 นาโนเมตร โดยกรดนิวคลีอกทมความบริสุทธิอยูในเกณฑดตองมอตราสวนดังกลาวอยาง

่
็
ี

็
ี
ึ

่
ํ

ั
ี
ี
ึ
่
นอยเทากบ 1.8 และอกประการหนึงทตองคานึงถง คือ ขนาดของดเอนเอ ซงในการเตรียมดเอนเอจําเปนตอง
ี

ทําดวยความนิมนวล เบามือ เพ่อปองกันการฉีกขาดของโมเลกุลดีเอนเอโดยเฉพาะดเอนเอท่มลักษณะเปน
ื

็
ี
็

ี
่
เกลียวคูสายยาว
ขั้นตอนของการแยกสกัดดีเอ็นเอ ในการสกัดดีเอ็นเอมักประกอบดวยขั้นตอนดังนี้ คือ
่

1. การทาใหเซลลแตก สามารถทาไดโดยวิธีกล เชน ดวยการบดเนื้อเยือรวมกับไนโตรเจนเหลว

ํ
ํ


ี
ั


ี
ํ
ใหเปนผงละเอยด หรือการทาใหเซลลแตกดวยสารเคมหรือเอนไซม ตวอยางเชน ยอยผนังเซลลดวยเอนไซม 
เชน lysozyme, cellulose, chitinase
ิ้
2. ขั้นตอนของการกําจัดเศษเซลลและการกําจัดโปรตีนที่ไมตองการทง สามารถทําไดโดยการทํา
ใหโปรตีนเสียสภาพธรรมชาตโดยการเตมสารทเปน ionic detergent เชน sodium dodecyl sulfate (SDS)
ี่
ิ
ิ
ื

่

ํ
ิ
เพอเปนการลดแรงดงดูดระหวางโปรตีนและกรดนิวคลีอิก หรือการกาจัดโปรตีนโดยการเตมสารทเปนดางจัด
ึ
่
ี

ไดแก สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด 
่
ํ
ิ
3. การแยกสกดโปรตนออกจากกรดนิวคลีอกดวยตัวทาละลายอนทรีย โดยสารทนิยมใช ไดแก 

ี
ิ
ั

ี
ฟนอล และคลอโรฟอรม ซงสารทงสองชนิดจะทาใหโปรตนเสียสภาพธรรมชาต และแยกโปรตนออกไปคนละ
ี
้
ิ
ั
ี

่
ึ
ํ
ี
่
ี
สวนของสารละลาย โดยกรดนิวคลีอิกจะละลายอยูในชั้นของน้ําสวนบน ขณะทโปรตนและสิงปนเปอนอ่นๆ จะ

่
ื
อยูระหวางชั้นของน้ํา และฟนอล/คลอโรฟอรม

ี
4. การตกตะกอนกรดนิวคลีอกดวยแอลกอฮอล โดยปกตกรดนิวคลีอกสามารถละลายไดดใน

ิ
ิ
ิ
ั
ี
ั
้
ื
ี
บพเฟอรท่มี pH เปนกลาง แตจะไมละลายในสารละลายท่เปนกรดหรือแอลกอฮอล ดงนันเม่อมการเตม
ิ
ี

ิ

แอลกอฮอลลงในสารละลายกรดนิวคลีอิกจึงทําใหกรดนิวคลีอิกเกดการรวมตัวเปนกลุมกอนขนาดใหญจน
สามารถมองเห็นไดดวยตาเปลา
็
5. การเก็บรักษากรดนิวคลีอกหรือดเอ็นเอท่แยกสกัดได ควรเกบอยูในน้ําบริสุทธิ์หรือบัพเฟอร
ี

ี
ิ
เชน บัพเฟอร TE ที่สะอาดปราศจากสิ่งปนเปอนที่อุณหภูมิ -20 หรือ -80 องศาเซลเซียส
ิ
การสกัดพลาสมดดีเอนเอจากเซลลแบคทเรียดวยวธี Alkaline Lysis การสกดพลาสมดดเอ็นเอ
ิ

็
ั
ี
ิ
ี
จากเซลลแบคทเรีย โดยวิธีการทาใหเซลลแบคทเรียแตกสลายดวยสารละลายท่มสวนประกอบของ sodium
ํ
ี

ี
ี
ี
hydroxide (NaOH) และ sodium dodecylsulfate (SDS) โดยท SDS จะทําใหเกดการเสียสภาพตาม
ี
ิ
่
ํ
ธรรมชาตของโปรตนในเซลลแบคทเรีย สวน NaOH จะทาใหเกิดการเสียสภาพตามธรรมชาตของโครโมโซม
ี
ิ
ิ
ี
ื
ื
่
่
และพลาสมดดเอนเอ ซงเมอทาการเตมสารละลาย potassium acetate ท่มีสภาพเปนกรด เพ่อปรับสภาพ
ี
ี
็
ึ
ิ
ํ
ิ
ี
ื
่
่
ี
ี
ํ
สวนผสมจากสภาวะทเปนดางใหกลับคนสภาพเปนกลาง (neutralisation) พลาสมดดเอนเอทถกทาใหเสีย
ู
็
ิ
้
ี
่
ี
สภาพไปกอนหนานี จะกลับคนสูสภาพเดิมอยางรวดเร็ว ในขณะทโปรตนและโครโมโซมทเสียสภาพธรรมชาต ิ
ื
ี
่



ู
ไมสามารถกลับคืนสูสภาพเดิมได และจะถกจับไวดวยโครงสรางท่มความซับซอน ทเกดจากการรวมตัวกน
ั
่
ิ
ี
ี
ี
่
ี


ระหวาง SDS และ potassium ตกตะกอนออกมาใหเห็นเปนกอนสีขาว และภายหลังทไดทาการแยกตะกอน
ํ




ขาวออกไปโดยการปนเหวียงหรือการกรองพลาสมดจะถกแยกออกมาจากสวนผสม โดยการตกตะกอนดวย
่
ู
ิ
แอลกอฮอลบริสุทธิ์ (ethanol precipitation) (จุฑาพร แสงประจักษ, 2554)
