Page 112 - ปฏิบัติการ Lab Bilology II
P. 112
ิ
ปฏบัติการชววิทยา 2 [Biology Laboratory 2] ภาควิชาชววิทยา คณะวิทยาศาสตร มมส.
์
ี
ี
104 ผศ.ดร.จฑาพร แสงประจักษ ์
ุ
่
่
ี
การตรวจสอบปริมาณและคุณภาพของดีเอ็นเอ การทสิงมีชีวิตพวกยูคาริโอตและโปรคาริโอตม ี
ั
ี
ั
็
ั
ึ
ความยาวของดเอนเอแตกตางกนมากจึงทาใหในข้นตอนของการแยกสกดดีเอนเอจากยูคาริโอตซงมความยาว
่
ี
ํ
็
ี
ั
มากๆ จําเปนตองทําดวยความระมดระวังเพ่อปองกันการฉกขาดและการเสียสภาพธรรมชาติของดเอ็นเอ
ี
ื
ี
ี
ี
ิ
ี
เพราะการทเกดการฉกขาดหรือเสียสภาพยอมมผลโดยตรงตอโครงสรางและหนาท่ของดีเอ็นเอไดดีเอ็นเอท ่ ี
่
สกัดไดจะมีลักษณะเปนสารละลายใส ซึ่งสามารถบงชี้วาสารละลายดงกลาวเปนดเอนเอไดโดยอาศยคณสมบต ิ
ั
็
ี
ั
ั
ุ
ุ
่
่
ู
่
การดดกลืนคลืนแสงอลตราไวโอเลตของเบสทเปนองคประกอบของดีเอนเอ ทความยาวคลืน 260 นาโนเมตร
ี
่
ี
็
่
โดยการดดกลืนคลืนแสง 1 หนวย (OD) ทความยาวคลืน 260 นาโนเมตร จะมปริมาณของดีเอนเอประมาณ
็
ี
่
่
ี
ู
ํ
ี
ิ
ั
็
ี
ี
่
ุ
50 ไมโครกรัม และสามารถตรวจสอบคณภาพของดเอนเอทสกดได โดยการทาอเล็กโทรโฟริซสแบบอะกาโรส
(agarose gel electrophoresis) โดยอาศยโครงสรางของสายดีเอนเอในธรรมชาตทมกพบในลักษณะ 2 สาย
่
็
ิ
ี
ั
ั
คกน อยูในสภาพเกลียวคทเปนแบบ 2 สายสวนทางกน (antiparallel) มคเบสจับกนเปนขนบนได ทาใหสาร
ํ
ั
ู
ั
ั
้
ู
ี
ั
่
ั
ู
ี
ี
็
่
ุ
ื
เรืองแสง เชน เอทิเดียมโบรไมด (EtBr) แทรกเขาไปในเกลียวคูของดเอนเอ เมอสองดวยแสงอลตราไวโอเลตจะ
เห็นเรืองแสงไดดีข้น โดยถาดเอ็นเอท่สกัดไดมีคุณภาพดจะเห็นแถบเรืองแสงเดยวแตถาคณภาพของดเอนเอ
ุ
ี
ี
ึ
ี
ี
็
ี
ไมดี มีการแตกหักของสายดีเอ็นเอเปนสายสั้น ๆ (DNA fragment) จะเห็นแถบเรืองแสงคลายดาวหางบนแผน
อะกาโรส (ภาพที่ 9.6)
นอกจากนียังสามารถตรวจสอบคณภาพของดเอนเอไดโดยการหาอตราสวนของคาการดดกลืนแสง
ั
็
ู
ุ
ี
้
ี
ี
ที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร ตอความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร หากวาดเอนเอทสกดไดมคณภาพทด ม ี
ั
็
่
ี
ี
ี
่
ุ
ี
ความบริสุทธิ์มาก จะมีคาอัตราสวนดังกลาวเทากับ 1.7-1.8 แตถาดเอนเอทสกดไดมีสวนของอารเอนเอเจือปน
่
็
็
ี
ั
อยูจะมีคามากกวา 1.8 เนื่องจากอารเอ็นเอจัดเปนกรดนิวคลิอิกชนิดหนึ่ง ดังนั้น จึงมีเบสที่สามารถดดกลืนแสง
ู
ํ
็
ั
ี
ี
ั
ี
ั
ึ
อลตราไวโอเลตไดเชนกัน จึงทาใหคาการดูดกลืนแสงอลตราไวโอเลตมากข้น และถาดีเอนเอทสกดไดมโปรตน
่
ี
ู
ี
่
ู
ี
ี
่
ปนเปอนอยูจะมีคาอัตราสวนนอยกวา 1.7 เนื่องจากโปรตนมหมทสามารถดดกลืนคลืนแสงไดท่ความยาวคลื่น
280 นาโนเมตร
ภาพที่ 9.6 การตรวจสอบปริมาณและคุณภาพของดีเอ็นเอดวยวิธีเจลอิเล็กโทรโฟริซีส
ี
(ทมา: Campbell and Reece, 2002)
่
